实验原理

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，因此不易染色。在常规染色法中，只有细菌体会被染色，而芽胞则保持无色透明状态。芽孢染色法正是基于这一特性设计，利用芽孢在被染色后不易脱色的特点进行检测。所有芽孢染色法都遵循同一原则：运用强色力的染料并配合加热以促进芽胞染色。在染色过程中，细菌体也会被染色，随后通过水洗去除细菌体的颜色，而芽胞因其特殊性质，所染颜色不易流出。接下来，再用对比度强的染料对细菌体复染，使得细菌体和芽胞呈现出不同的颜色，从而便于观察芽胞的存在。

实验器材

1. 活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
2. 染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。
3. 器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

实验方法

1. 改良的Schaeffer和Fulton氏染色法：
（1）制备菌液：在小试管中加入1-2滴无菌水，用接种环从斜面提取2-3环的菌体至试管，充分打匀以制成浓稠的菌液。
（2）加染色液：向小试管中加入2-3滴5%孔雀绿水溶液，使用接种环搅拌以确保染料与菌液混合均匀。
（3）加热：将试管置于沸水中加热15-20分钟。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑取数环菌液于洁净的载玻片上，制成涂层，待其晾干。
（5）固定：将涂片在酒精灯火焰中固定3次。
（6）脱色：用水冲洗，直至流出的水中不再含有孔雀绿颜色。
（7）复染：用番红水溶液染色5分钟，倾去染色液，使用吸水纸轻轻吸干。
（8）镜检：先用低倍镜检，再用高倍镜，以及最后在油镜下观察芽胞与菌体的形态。

结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

2. Schaeffer与Fulton氏染色法：
（1）涂片：按常规方法制备待检细菌的涂片。
（2）晾干并固定：待涂片晾干后，在酒精灯火焰中固定2-3次。
（3）染色：
① 加染色液：在涂片上加入足够的5%孔雀绿水溶液，然后将涂片放置在铜板上，加热至染液冒蒸汽时开始计时，约15-20分钟。在加热过程中需要持续添加染色液，确保标本不干燥。
② 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻冲洗，直至流出的水中不再含有染色液。
③ 复染：用番红液染色5分钟。
（4）水洗、晾干或用吸水纸吸干。
（5）镜检：依次用低倍、高倍，最后在油镜下观察芽胞及菌体的形态。

结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。

注意事项

1. 用于芽孢染色的菌种应控制其菌龄。
2. 改良法在节省染料、简化操作及提高标本质量方面优于常规涂片法，建议优先使用。
3. 在使用改良法时，为确保获得优质涂片，首先需制备浓稠的菌液，其次在提取染色的菌液时，应充分搅拌，以确保获取足够的细菌体，否则可能导致涂片时细菌体数量不足。