无论是在体外难以感染的细胞中构建慢病毒文库，还是在体内进行AAV文库的研究，确定最佳剂量以确保单个靶点仅能感染一个细胞，一直是研究者们面临的难题。文库实验的目标是识别单基因引发的功能变化，因此必须控制每个细胞仅接收一个靶点的病毒。

在细胞实验的文库筛选中，建议首先使用对照病毒进行预实验，从而探寻最佳的MOI（感染效率达到80%的MOI）。具体操作中，建议将文库操作的MOI设置为最佳MOI的三分之一，以此来减少病毒用量，防止多重感染。这一方法简单有效，能够在一定程度上解决感染细胞重复性过高的问题。

然而，对于难以感染的细胞类型，如免疫细胞，以及体内实验，确定最佳剂量以确保单个靶点仅能感染一个细胞的难度依然很大。这是因为在某些情况下，最佳MOI可能只有30%的感染效率，若按一比三的用量减少，几乎无法获得成功感染的细胞。

尊龙凯时推出的三色荧光（mTagBFP、Venus、mCherry）病毒，为研究者提供了更为有效的文库感染预实验工具。这种三色荧光病毒包括慢病毒和AAV两种产品类型，特别适用于在体内实验中摸索剂量。

根据《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》的研究，三色荧光病毒的实验提供了一种可行的方法来测试AAV是否可以在低感染复数下感染大量细胞。研究者进行了体内滴定实验，准备了三种不同剂量的AAV，分别为25E9、5E9和5E10颗粒，并选择了phpb血清型。通过流式细胞术筛选，可以确定较低剂量下的双病毒感染的控制。

最终实验结果显示，5E9的剂量能够最大化单个AAV感染的细胞总数，因此被选为最佳剂量。为此，病毒构建方案采用了CBh启动子控制下的mTagBFP、Venus和mCherry的独立表达。

研究显示，在全身注射不同剂量的三种AAV的等比例混合物后，感染细胞核（即至少表达一种荧光蛋白的细胞核）的比例明显提高，也为进一步研究提供了参照。

无论是在细胞实验还是动物实验中，使用尊龙凯时的三色荧光病毒进行相关预实验，都可通过设置不同剂量梯度来进行细胞感染或小鼠体内注射。借助流式分析的方法，可以明确转染效率和单荧光细胞的比例。通过对比得出，单病毒感染比例及感染细胞数量比例最高的剂量，将被确认为最佳实验剂量，用于文库的实际实验。

参考文献：Santinha, AJ, Klingler, E, Kuhn, M et al. "Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq." Nature 622, 367–375 (2023).